Nuevas Tecnologías para Electroforesis

Nov 10, 2023

Angelo DePalma es un escritor independiente que vive en Newton, Nueva Jersey. Puede comunicarse con él en [email protected].

Concebida a fines de la década de 1980, la idea del "laboratorio en un chip" buscaba crear el equivalente de un laboratorio analítico completo en losas de silicio, vidrio y plástico del tamaño de una caja de cerillas. La mayoría de estos dispositivos se basaron en la electroforesis capilar, un modo analítico que sigue predominando en los dispositivos analíticos de microfluidos.

El sueño de fabricar algo parecido a un laboratorio completo en un sustrato del tamaño de una caja de cerillas nunca se realizó, pero ha surgido instrumentación comercial que realiza electroforesis directa en chips. Estos sirven principalmente a las ciencias de la vida, incluidos los diagnósticos médicos. Un informe de investigación de mercado estima una sólida tasa de crecimiento anual del siete por ciento para tales sistemas.

PerkinElmer ofrece dos plataformas de electroforesis microfluídica: el analizador de ácido nucleico LabChip® GX Touch™ para ADN y ARN, y el sistema de caracterización de proteínas LabChip® GXII Touch™ para proteínas y glicanos. Ambos sistemas proporcionan plataformas de alto rendimiento para la separación, el dimensionamiento y la cuantificación de biomoléculas basadas en electroforesis. PerkinElmer desarrolló métodos especiales de microfabricación que incrustan canales de bajo tamaño micrométrico en microchips de vidrio y cuarzo delgados. Los microchips interactúan con el instrumento a través de caddies de plástico para facilitar la carga de muestras y el acoplamiento con la instrumentación.

"Las principales ventajas del análisis de biomoléculas basado en microfluidos frente al basado en gel son el rendimiento, la resolución, la facilidad de uso, la sensibilidad y la versatilidad", dice James Atwood PhD, gerente general de automatización y microfluidos en PerkinElmer. "La electroforesis en gel tradicional lleva mucho tiempo, requiere mucha mano de obra, es propensa a la variabilidad y consume grandes cantidades de muestras valiosas".

Los ensayos basados ​​en microfluidos de LabChip consumen solo 150 nanolitros de muestra por separación y son compatibles con muestras de ácido nucleico y proteínas en los rangos de concentración bajos de pg/μL y ng/mL, respectivamente. El rendimiento de hasta 384 muestras por ciclo para LabChip supera con creces el de los sistemas basados ​​en gel y las biomoléculas, como los glicanos ligados a N, que no se pueden modificar para la separación basada en gel por electroforesis, pero se pueden separar y detectar en sistemas de microfluidos. Otra ventaja importante de la separación de biomoléculas basada en microfluidos es la separación y cuantificación de proteínas nativas, basándose únicamente en la carga, para detectar variantes de carga. La electroforesis en gel no puede resolver las variantes de carga de proteínas.

En los flujos de trabajo típicos de espectrometría de masas basados ​​en electroforesis en gel, los compuestos primero se separan en el gel y luego se eliminan las bandas correspondientes a las biomoléculas de interés. En los flujos de trabajo proteómicos, las proteínas se degradan enzimáticamente y los fragmentos peptídicos se extraen del gel antes de la LC-MS/MS. Si bien este enfoque tiene varias ventajas, incluido ser un modo de separación ortogonal, es extremadamente tedioso.

Se han desarrollado varios sistemas basados ​​en microfluidos que permiten el acoplamiento directo de un chip de microfluidos a un sistema de HPLC y un espectrómetro de masas. En estos sistemas de microcromatografía, los canales de microfluidos se empaquetan con una fase estacionaria que es específica para el modo de separación deseado. Esto permite la captura y/o separación automatizada de biomoléculas directamente en el chip con elución, ionización y detección en el espectrómetro de masas. A diferencia de los enfoques basados ​​en gel, los sistemas de microcromatografía son fáciles de automatizar y se pueden adaptar para enfocarse en biomoléculas específicas de interés en función de la modificación del material de empaque.

Los chips utilizados con el sistema Agilent 2100 Bioanalyzer consisten en un carrito de plástico con 16 pocillos que se utilizan para la aplicación de reactivos y muestras. Cada chip está etiquetado con identificadores para el tipo de ensayo, el número de lote y la configuración del chip específico del ensayo. El chip de vidrio incorpora microcanales grabados y está pegado en la parte trasera del carrito. "El proceso de producción del chip de vidrio y el canal de separación es similar al de los dispositivos semiconductores", dice Eva Graf, gerente de productos para bioanalizadores de Agilent Technologies (Santa Clara, CA). Agilent utiliza máscaras protectoras especiales para chips de proteínas y ácidos nucleicos, que reflejan la estructura del canal. Cuando las virutas de vidrio se exponen al agente de grabado, solo los canales se graban en el vidrio. La superficie restante del chip está protegida por la máscara.

El sistema de microcanales conecta todos los pozos del caddy con la cruz de inyección y el canal de separación. Antes de aplicar las muestras, los microcanales se llenan con una mezcla de gel separador y colorante fluorescente. Durante la ejecución del chip, se aplica un alto voltaje en varios pasos de acuerdo con un guión específico del ensayo que refleja el diseño de los microcanales en el chip de vidrio. "El guión coordina el predibujado, la inyección electrocinética y, por supuesto, la separación electroforética de las muestras", explica Graf. "La separación electroforética simultánea y la extracción previa de la muestra subsiguiente reducen el tiempo de análisis a minutos por muestra". Luego, los analitos separados se detectan dentro del canal de separación mediante fluorescencia inducida por láser y la señal se traduce en imágenes y electroferogramas de tipo gel.

La electroforesis en un chip permite una separación de alta resolución que requiere solo un volumen de muestra mínimo, lo que hace que la tecnología sea atractiva para el control de calidad de muestras preciosas antes de cualquier aplicación posterior.

Para Agilent, las mejores aplicaciones de chips de electroforesis incluyen el control de calidad de la biblioteca en los flujos de trabajo de secuenciación de última generación. Según Graf, el cálculo preciso de la distribución del tamaño y la concentración de la muestra antes de la secuenciación es crucial para lograr una densidad de grupos óptima, y ​​la evaluación de la cantidad y la calidad del material de partida experimental es esencial para el éxito de la investigación. "Cuando se usa ARN como material de partida para el análisis de expresión génica mediante NGS, micromatrices o qPCR, la degradación de la ARNasa es una razón común para los experimentos fallidos. Los ensayos de ARN basados ​​en chips facilitan la detección visual incluso de los efectos de degradación pequeños y la integridad del ARN número permite la calificación objetiva de la muestra".

Por el contrario, la electroforesis en gel tradicional solo permite la estimación de la integridad de la muestra, que es propensa a la interpretación dependiente del usuario. "La alta sensibilidad y un gran rango dinámico lineal de los ensayos de ADN lo convierten en una herramienta óptima para analizar fragmentos amplificados por PCR o digeridos por enzimas de restricción, y permite una fácil evaluación de la eficiencia de escisión del ARNg sintetizado en la edición del genoma", dice Graf.

En el lado del análisis de proteínas, los EPC proporcionan una forma rápida y confiable de reemplazar los métodos analíticos SDS-PAGE. Las aplicaciones típicas incluyen la evaluación del tamaño, la pureza y la concentración de proteínas durante procesos como la expresión de proteínas recombinantes, la purificación de proteínas, los estudios de estabilidad o el análisis general de anticuerpos.

Los gerentes de laboratorio evalúan la instrumentación en función de sus capacidades, no de su factor de interés. Por lo tanto, los compradores de sistemas basados ​​en chips deben asegurarse de que los sistemas en consideración proporcionen la profundidad y amplitud de los ensayos que esperan ejecutar.

Graf recomienda sistemas que ofrezcan ensayos "apropiados para su tipo de muestra, especialmente en lo que respecta a la concentración de la muestra, el tamaño de la muestra, el tipo de muestra (ADN, ARN, proteína, etc.)", siempre teniendo en cuenta el rendimiento de la muestra. "Además, considere los servicios del proveedor para soporte, garantía, reparación e instalación, y la facilidad de uso del sistema, todo lo cual puede ayudar a reducir al mínimo el tiempo de inactividad del laboratorio".

Los volúmenes de muestra se han convertido en un punto de venta importante con todos los instrumentos analíticos. Los volúmenes más pequeños consumen menos reactivo y menos muestra, y permiten a los investigadores hacer más con muestras raras o escasas. El bioanalizador 2100 de Agilent, por ejemplo, requiere solo un microlitro de muestra para ensayos de ARN y ADN.

El cumplimiento normativo es un problema para los laboratorios de I+D farmacéuticos, siendo 21 CFR parte 11 la normativa aplicable que cubre los registros electrónicos. El cumplimiento también juega en las operaciones estándar para los laboratorios de diagnóstico y cualquier instalación con una interacción continua con el sistema legal o de patentes, por ejemplo, análisis forense.

El costo siempre es una consideración, pero para la instrumentación que los laboratorios usan todos los días, se debe considerar el costo de propiedad con respecto al consumo de energía y reactivos. Los planes de servicio tienden a ser integrales, con una respuesta generalmente rápida, pero los laboratorios muy ocupados también deben considerar el impacto económico del tiempo de inactividad.